A causa della guerra con la Spagna, seguono anni di difficoltà economiche. Nel 1560 il Capitolo della Basilica riduce le spese per la cappella, Palestrina lascia improvvisamente l'incarico e porta via il figlio primogenito, ivi fanciullo cantore.
Nel 1561 diviene maestro a S. Maria Maggiore, incarico che lascerà dopo il gennaio 1565. Nel 1565 assunse l'insegnamento musicale nel Seminario Romano, istituito da una delibera del Concilio di Trento. Dal 1567 ottenne l'incarico permanente di dirigere le feste del cardinale Ippolito d'Este nelle sue sedi romane, Monte Giordano e Monte Cavallo, nonché nella villa di Tivoli. In quello stesso anno usciva il Missarum Liber Secundus comprendente la «Papae Marcelli». La raccolta è dedicata a Filippo II di Spagna. Sempre dedicato al re di Spagna è il Terzo Libro di Messe del 1570. Queste dediche erano mirate a trovare un protettore fuori dall'ambiente romano, sfavorevole in quel periodo agli artisti. Nonostante tutte le trattative, la corte di Vienna trovò esagerata la somma di 400 scudi annui.
Nel 1538 Palestrina cercò di entrare a Mantova, dove Guglielmo Gonzaga si era circondato di un buon complesso di musici. Per vent'anni, fino al 1587, Palestrina ebbe un rapporto epistolare con il duca. La prima lettera era allegata alla prima delle dieci «Messe Mantovane». Le altre nove messe furono composte e spedite tra il 1578 e il 1579. Anche il duca si rifiutò di assumerlo come maestro di Cappella di Santa Barbara in Corte per il compenso troppo alto che il compositore richiedeva. Il disagio di Palestrina in questi anni derivava dalla vigilante diffidenza che dal 1560 circondava gli artisti. Il Concilio di Trento aveva rimesso ai vescovi la decisione sull'ammissibilità del canto figurato nelle funzioni liturgiche (1562-63) Questo significava instabilità finanziaria e frustrazione artistica.
Nel 1571 gli venne offerta la direzione della Cappella Giulia dopo la morte di Animuccia, con uno stipendio di 100 scudi, aumentato dopo pochi anni a 185. Prese in affitto e poi comprò una casa vicino a San Pietro, in un vicolo detto poi «del Pelestrino», dove passò gli ultimi 23 anni di vita.
Nel 1572 morì il suo primogenito Rodolfo, pochi mesi dopo il fratello minore Silla e nel '75 anche il secondogenito Angelo. Sono di questi anni le composizioni più intensamente dolorose, con spunti sentitamente drammatici (1573-75): gli Improperii e le Lamentazioni. Nel 1578 Palestrina ebbe l'incarico da papa Gregorio XIII di emendare dagli errori e dalle interpolazioni accumulatesi nel corso dei secoli le melodie gregoriane dell'Antifonario e del Graduale Romano.
Nell'estate del 1580 un'epidemia di "febbre catarrale" gli uccise la moglie. Sconvolto dal lutto decise di prendere i voti ma nel febbraio del 1581 sposò una agiata vedova che gli portò in dote un ben avviato negozio di pelliccerie.
Tra il 1581 e il 1594 pubblica 17 volumi di sue opere. Nell'ultimo periodo della sua vita la fama è sicura e indiscussa. Palestrina appare tra i fondatori della Vertuosa Compagnia de li Musici da cui avrà origine l'Accademia di Santa Cecilia.
La morte lo colse dopo brevissima malattia mentre stava preparando l'edizione del Settimo Libro delle Messe.
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